Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ubr1: sc-403943-ACT

UBR1 humain code l’E3 ubiquitine-ligase Ubr1, un composant clé de reconnaissance de la voie N-end rule, qui relie les degrons N-terminaux à une dégradation protéasomale dépendante de l’ubiquitine. En contrôlant la stabilité de protéines mal repliées, endommagées ou régulatrices, Ubr1 contribue au contrôle qualité des protéines dans le cytosol, à l’adaptation au stress et à des réseaux plus larges de protéostasie qui s’articulent avec le système ubiquitine–protéasome. L’activité d’UBR1 influence l’homéostasie cellulaire via une dégradation régulée des substrats, avec des répercussions sur la dynamique des voies de signalisation et les réponses métaboliques. Des altérations génétiques d’UBR1 sont associées à des phénotypes de maladies héréditaires, soulignant son intérêt pour l’étude des mécanismes de défaillance de la protéostasie et des relations génotype–phénotype dans les cellules humaines.

Ubr1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ubr1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ubr1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ubr1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ubr1 dans les cellules tumorales présentant une expression de UBR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.