TS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402479-ACT

O TYMS humano codifica a timidilato sintase (TS), uma enzima citosólica que catalisa a conversão de novo de dUMP em dTMP, fornecendo uma fonte essencial de timidilato para a replicação e o reparo do DNA. Ao controlar a disponibilidade de dTTP, a TS sustenta a progressão da fase S e influencia a estabilidade do genoma por sua conexão com o metabolismo de um carbono dependente de folato. A atividade de TYMS integra-se às redes de biossíntese de nucleotídeos e às respostas ao estresse replicativo, e a expressão alterada é frequentemente estudada em contextos de estados proliferativos e de tolerância a danos no DNA. A desregulação de TYMS tem sido associada a mudanças no controle do crescimento celular e à reprogramação metabólica, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos da homeostase de nucleotídeos.

TS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TYMS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TYMS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TYMS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TYMS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TS em células tumorais com expressão de TYMS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.