Plasmide CRISPR d'Activation (h) Troponin T-SS: sc-402749-ACT

TNNT1 code la troponine T des muscles squelettiques lents (Troponin T-SS), un composant central du complexe de la troponine qui ancre les sous-unités régulatrices à la tropomyosine sur le filament fin et module les interactions actine–myosine dépendantes du Ca²⁺. En couplant le signal calcique à la mécanique de contraction du sarcomère, TNNT1 influence l’assemblage des myofibrilles, la génération de force contractile et la physiologie musculaire spécifique du type de fibre. Une expression ou une fonction altérée de TNNT1 est liée à des dysfonctionnements des muscles squelettiques et a été associée à des phénotypes de maladies neuromusculaires congénitales, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la régulation sarcomérique, du développement musculaire et des réponses au stress liées à la contractilité. TNNT1 est donc largement utilisé comme marqueur et comme nœud mécanistique dans les voies qui gouvernent le couplage excitation–contraction et l’intégrité des fibres musculaires.

Troponin T-SS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNNT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Troponin T-SS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNNT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNNT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Troponin T-SS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNNT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Troponin T-SS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Troponin T-SS dans les cellules tumorales présentant une expression de TNNT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.