Troponin C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403315-ACT

Das humane TNNC2-Gen kodiert Troponin C, eine Ca2+-bindende regulatorische Untereinheit des Troponin-Komplexes, der die Aktin–Myosin-Interaktionen in quergestreifter Muskulatur steuert. Durch das Erfassen zytosolischer Calciumtransienten über EF-Hand-Motive löst Troponin C Konformationsänderungen im dünnen Filament aus, die die Erregungs-Kontraktions-Kopplung und die Kraftentwicklung im Sarkomer koordinieren. Die TNNC2-abhängige Calciumsignalgebung ist mit der Myofibrillenassemblierung und der funktionellen Spezialisierung von Muskelfasern verknüpft und beeinflusst die Kontraktionskinetik in schnell zuckender Muskulatur. Eine veränderte, troponinvermittelte Calciumantwort und sarkomerische Regulation ist relevant für Studien zu Muskelschwäche, Myopathien und weiter gefassten Phänotypen der Skelettmuskeldysfunktion.

Troponin C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNNC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Troponin C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNNC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNNC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Troponin C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNNC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Troponin C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Troponin C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNNC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.