Triadin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-429407-ACT

O Trdn de camundongo codifica a triadina, uma proteína de membrana do retículo sarcoplasmático juncional que organiza o acoplamento excitação–contração no músculo estriado ao atuar como arcabouço para o receptor de rianodina (RyR), a calsequestrina e parceiros luminais associados. Por meio desse complexo de liberação de cálcio, a triadina ajuda a regular o armazenamento de Ca²⁺ no RS e a cinética de sua liberação, conectando a despolarização de membrana à contração dependente de Ca²⁺ e a programas de sinalização a jusante responsivos ao cálcio. Alterações na função de TRDN perturbam a homeostase de Ca²⁺, desestabilizam o comportamento do canal do receptor de rianodina e estão associadas a fenótipos musculares e cardíacos ligados a mecanismos arritmogênicos e miopáticos. Assim, Trdn é amplamente estudado em vias que governam a arquitetura das junções do RS, o manejo de cálcio e a fidelidade do acoplamento excitação–contração em cardiomiócitos e fibras musculares esqueléticas.

Triadin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Trdn sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Triadin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Trdn em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Trdn, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Triadin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Trdn nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Triadin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Triadin em células tumorais com expressão de Trdn silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.