TPPP Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-405957

Descripción general

TPPP (proteína promotora de la polimerización de tubulina), también conocida como p25, es una proteína asociada a los microtúbulos enriquecida en oligodendrocitos que modula la polimerización de la tubulina y estabiliza la red de microtúbulos. Mediante la regulación de la dinámica de los microtúbulos, TPPP contribuye a la organización del citoesqueleto, al transporte intracelular y a programas de diferenciación vinculados a la mielinización y a la morfología celular. Su interacción funcional con la tubulina y con vías de remodelación del citoesqueleto conecta a TPPP con mecanismos que controlan la polaridad celular y la formación de prolongaciones tipo neurita. La alteración de la expresión de TPPP o de su comportamiento proteico se ha asociado con procesos relevantes para enfermedades neurodegenerativas, incluida la biología de la agregación proteica y las disrupciones de la homeostasis dependiente de microtúbulos.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO TPPP (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen TPPP en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus TPPP, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR TPPP (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido TPPP.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido TPPP CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto TPPP.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus TPPP y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones TPPP críticos para la función TPPP
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.