TNAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400784-ACT

ALPL kodiert die gewebsunspezifische alkalische Phosphatase (TNAP), ein über einen Glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-Anker membrangebundenes Ectoenzym, das extrazelluläre Phosphat-Monoester hydrolysiert und so das Gleichgewicht von anorganischem Phosphat und Pyrophosphat reguliert. Durch die Kontrolle der Pyrophosphatverfügbarkeit und die Bereitstellung von Phosphat für die Hydroxylapatitbildung ist TNAP ein zentraler Regulator von Mineralisierungsprogrammen und der Osteoblastendifferenzierung und steht zudem über den Metabolismus von Nukleotiden wie ATP mit der purinergen Signalübertragung in Verbindung. Die TNAP-Aktivität beeinflusst außerdem die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix und die Neigung zur Verkalkung in Knochen- und Gefäßgewebe. Eine Fehlregulation der ALPL/TNAP-Funktion ist mit abnormen Mineralablagerungen und skelettalen Phänotypen assoziiert und ist daher relevant für Studien zur Knochenbiologie, zu Verkalkungswegen und zur Phosphathomöostase.

TNAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALPL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TNAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALPL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALPL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TNAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALPL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TNAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TNAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALPL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.