TMEM38B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412461-ACT

TMEM38B codifica o canal catiônico intracelular trimérico A (TRIC-A), uma proteína de membrana do retículo endoplasmático/retículo sarcoplasmático (RE/RS) que forma canais para cátions monovalentes, sustentando a liberação de Ca2+ ao fornecer fluxo de contra-íons. Ao estabilizar o potencial de membrana do RE/RS durante a sinalização de cálcio dependente dos receptores de IP3 e de rianodina, TMEM38B contribui para o acoplamento excitação–contração, a homeostase do cálcio intracelular e programas transcricionais regulados por cálcio a jusante. A disfunção de TMEM38B tem sido associada ao desenvolvimento esquelético e à integridade do tecido conjuntivo, com variantes de perda de função relacionadas a fenótipos semelhantes aos da osteogênese imperfeita. Essas características tornam TMEM38B relevante para estudos mecanísticos do manejo de cálcio no RE, da biologia da matriz e de respostas de sinalização associadas ao estresse em células humanas.

TMEM38B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TMEM38B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TMEM38B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TMEM38B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TMEM38B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TMEM38B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TMEM38B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TMEM38B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TMEM38B em células tumorais com expressão de TMEM38B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.