TFPI Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416811-ACT

O TFPI humano (inibidor da via do fator tecidual) é um inibidor secretado de serinoproteases do tipo Kunitz que restringe o início da coagulação sanguínea ao inibir o complexo fator tecidual–fator VIIa e o fator Xa, limitando assim a geração de trombina a jusante. A atividade do TFPI interage com a biologia endotelial, a homeostase vascular e a sinalização inflamatória, e a sua regulação influencia o equilíbrio entre vias pró-coagulantes e anticoagulantes. Alterações na expressão ou na função do TFPI têm sido associadas a fenótipos de risco trombótico e à fisiopatologia vascular, tornando-o um alvo útil para estudar mecanismos associados à coagulação em células endoteliais e em sistemas modelo relevantes para o plasma.

TFPI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TFPI sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TFPI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TFPI em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TFPI, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TFPI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TFPI nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TFPI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TFPI em células tumorais com expressão de TFPI silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.