TAT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405240-ACT

O TAT humano codifica a tirosina aminotransferase, uma enzima citosólica dependente de fosfato de piridoxal que catalisa a primeira etapa do catabolismo da tirosina ao converter L-tirosina em p-hidroxifenilpiruvato. Essa reação conecta a renovação de aminoácidos ao processamento hepático de nitrogênio e a vias a jusante que alimentam o metabolismo energético e o equilíbrio redox. A expressão de TAT é rigidamente regulada por sinais hormonais e nutricionais, integrando programas transcricionais que respondem a glicocorticoides e a estados de jejum. A perturbação da degradação da tirosina está associada a distúrbios metabólicos hereditários, como a tirosinemia tipo II, e pode informar estudos de fisiologia hepática, homeostase de aminoácidos e sinalização de estresse metabólico.

TAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TAT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TAT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TAT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TAT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TAT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TAT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TAT em células tumorais com expressão de TAT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.