TARDBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401890-ACT

TARDBP codifica a TDP-43, uma proteína de ligação a RNA/DNA que regula o splicing do pré-mRNA, a estabilidade do mRNA e o seu transporte, com papéis de destaque no metabolismo de RNA neuronal e na dinâmica de grânulos de stress. Ao ligar-se a motivos de RNA ricos em UG, a TDP-43 modula programas de splicing alternativo e mantém a integridade do transcriptoma, ligando-se a vias que controlam a proteostase, o transporte nucleocitoplasmático e as respostas celulares ao stress. A desregulação da localização e a agregação de TDP-43 é uma característica marcante de múltiplas doenças neurodegenerativas, e alterações no splicing dependente de TARDBP têm sido implicadas em redes génicas relevantes para a doença. Como resultado, TARDBP é amplamente estudado quanto a mecanismos de processamento de RNA, neurotoxicidade e controlo da expressão génica em modelos de células humanas.

TARDBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TARDBP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TARDBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TARDBP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TARDBP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TARDBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TARDBP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TARDBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TARDBP em células tumorais com expressão de TARDBP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.