SR-2B Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420994-ACT

Htr2b del topo codifica il recettore della serotonina SR-2B (5-HT2B), un recettore accoppiato a proteine G che segnala principalmente attraverso Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, il turnover dei fosfati dell’inositolo, la mobilizzazione del Ca²⁺ intracellulare e i programmi trascrizionali a valle mediati da PKC/ERK. SR-2B modula la neuromodulazione e la segnalazione serotoninergica periferica, influenzando l’eccitabilità neuronale, il tono vascolare e le risposte di rimodellamento tissutale. Alterazioni dell’attività di Htr2b sono state associate a una disregolazione degli output della via della serotonina, rilevante per fenotipi neurocomportamentali, processi di rimodellamento cardiovascolare e polmonare e contesti di segnalazione infiammatoria. In quanto nodo recettoriale di membrana, SR-2B rappresenta un punto d’ingresso pratico per studiare l’espressione genica guidata dal recettore, l’accoppiamento ai secondi messaggeri e il cross-talk di via con MAPK e reti dipendenti dal calcio.

SR-2B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Htr2b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SR-2B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Htr2b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Htr2b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SR-2B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Htr2b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SR-2B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SR-2B nelle cellule tumorali con espressione di Htr2b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.