SPTLC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403913-ACT

SPTLC2 codifica uma subunidade catalítica da serina palmitoiltransferase, a enzima limitante de velocidade que inicia a biossíntese de novo de esfingolipídeos ao condensar serina com palmitoil-CoA. Ao controlar a produção de ceramida e de esfingolipídeos complexos, a SPTLC2 influencia a composição da membrana, a organização de balsas lipídicas e processos de sinalização ligados à apoptose, à autofagia e às respostas celulares ao estresse. Alterações na atividade de SPTLC2 podem perturbar a homeostase dos esfingolipídeos e têm sido associadas a fenótipos metabólicos e neurodegenerativos, bem como a mecanismos relevantes para a sinalização inflamatória. Como os esfingolipídeos modulam a função de organelas e o tráfego vesicular, a SPTLC2 é amplamente estudada no metabolismo lipídico do retículo endoplasmático (RE), no crosstalk do estresse mitocondrial e na regulação do destino celular.

SPTLC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPTLC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPTLC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPTLC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPTLC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPTLC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPTLC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPTLC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPTLC2 em células tumorais com expressão de SPTLC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.