SmcX Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423030-ACT

Kdm5c (SmcX) codifica uma desmetilase de histonas contendo o domínio Jumonji C (JmjC), ligada ao cromossomo X, que remove as marcas H3K4me2/3, moldando a acessibilidade da cromatina e os programas transcricionais durante o desenvolvimento. Em células de camundongo, SmcX modula o controle epigenético da expressão gênica associado à diferenciação neuronal, à função sináptica e à transcrição dependente de atividade, interagindo com vias que regulam decisões de destino celular e estados de promotores/realçadores (enhancers) em todo o genoma. A interrupção ou desregulação de KDM5C está associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e a alterações da função cognitiva, em consonância com seu papel na manutenção de uma homeostase transcricional adequada. Assim, SmcX é um alvo útil para estudar a regulação guiada pela cromatina, redes gênicas neuronais e contribuições epigenéticas para estados celulares relevantes para doenças.

SmcX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Kdm5c sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SmcX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Kdm5c em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Kdm5c, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SmcX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Kdm5c nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SmcX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SmcX em células tumorais com expressão de Kdm5c silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.