Plásmido CRISPR de Activación (m) SmcX: sc-423030-ACT

Kdm5c (SmcX) codifica una desmetilasa de histonas con dominio Jumonji C (JmjC) ligada al cromosoma X que elimina las marcas H3K4me2/3, modulando la accesibilidad de la cromatina y los programas transcripcionales durante el desarrollo. En células de ratón, SmcX regula el control epigenético de la expresión génica asociado a la diferenciación neuronal, la función sináptica y la transcripción dependiente de la actividad, interactuando con vías que determinan decisiones de destino celular y estados de promotores/enhancers a escala genómica. La alteración o desregulación de KDM5C se asocia con fenotipos del neurodesarrollo y cambios en la función cognitiva, en consonancia con su papel en el mantenimiento de una homeostasis transcripcional adecuada. Por ello, SmcX es una diana útil para estudiar la regulación impulsada por la cromatina, las redes génicas neuronales y las contribuciones epigenéticas a estados celulares relevantes para enfermedades.

SmcX El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Kdm5c sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SmcX El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Kdm5c en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Kdm5c, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SmcX. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Kdm5c y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SmcX en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SmcX en células tumorales con expresión de Kdm5c silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.