Smad4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421527-ACT

O Smad4 de camundongo codifica um mediador transcricional central da sinalização canônica de TGF-β e BMP, formando complexos com SMADs reguladas por receptor para regular programas de expressão gênica que controlam decisões de destino celular, diferenciação, remodelamento da matriz extracelular e modulação imune. A atividade de Smad4 integra sinais de receptores de serina/treonina quinase até o núcleo, moldando respostas transcricionais dependentes do contexto em tecidos epiteliais e mesenquimais. A interrupção ou desregulação da sinalização dependente de SMAD4 é amplamente utilizada como arcabouço molecular para estudar mecanismos de supressão tumoral, fibrose, sinalização inflamatória e padronização do desenvolvimento em sistemas de mamíferos. Em modelos murinos e ensaios baseados em células, Smad4 fornece um nó tratável para investigar o crosstalk entre vias com as redes MAPK, WNT e PI3K/AKT.

Smad4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Smad4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Smad4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Smad4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Smad4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Smad4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Smad4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Smad4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Smad4 em células tumorais com expressão de Smad4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.