SLBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403637-ACT

A proteína de ligação a haste‑alça (SLBP) é um fator conservado de ligação a RNA que reconhece a estrutura de haste‑alça na extremidade 3′ dos mRNAs de histonas dependentes de replicação, coordenando o seu processamento, exportação nuclear, tradução e degradação rápida ao final da fase S. Ao acoplar o fornecimento de histonas à replicação do DNA, a SLBP dá suporte à montagem da cromatina, à estabilidade do genoma e à progressão ordenada do ciclo celular, integrando-se a checkpoints da fase S e a vias de resposta a danos no DNA. A atividade desregulada da SLBP pode perturbar a homeostase de histonas, levando a estresse replicativo, alterações na paisagem da cromatina e instabilidade transcricional. Como resultado, a SLBP é frequentemente investigada em contextos de biologia proliferativa e de desregulação do ciclo celular associada a tumores, como um nó mecanístico que conecta o processamento de RNA à manutenção da cromatina.

SLBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLBP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SLBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLBP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLBP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SLBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLBP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SLBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SLBP em células tumorais com expressão de SLBP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.