SARA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403648-ACT

ZFYVE9 codifica a SARA (Smad Anchor for Receptor Activation), uma proteína adaptadora endossomal com domínio FYVE que se liga ao fosfatidilinositol 3-fosfato e coordena a transdução de sinal dependente do tráfego intracelular. A SARA recruta SMAD2/3 para receptores de TGF‑β ativados, promovendo a fosforilação de SMAD e programas transcricionais a jusante que regulam a transição epitélio–mesênquima, a remodelação da matriz extracelular e a modulação imune. Por seu papel na sinalização TGF‑β/SMAD associada a endossomos e na comunicação cruzada com a dinâmica de membrana dependente de PI3K, a SARA ajuda a moldar decisões de destino celular e a homeostase tecidual. A desregulação de componentes da via de TGF‑β, incluindo recrutamento alterado de SMAD e mudanças na intensidade do sinal, está implicada em fibrose, progressão do câncer e distúrbios do desenvolvimento, sustentando o ZFYVE9 como um nó mecanístico para pesquisas focadas na via.

SARA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ZFYVE9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SARA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ZFYVE9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ZFYVE9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SARA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ZFYVE9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SARA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SARA em células tumorais com expressão de ZFYVE9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.