RILP CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402680-ACT

RILP（Rab 相互作用リソソームタンパク質）は、Rab7 の主要なエフェクターとして、後期エンドソームおよびリソソームの位置決め、成熟、ならびに微小管に沿ったカーゴ輸送を協調的に制御します。Rab7 陽性膜をダイニン–ダイナクチン運動複合体へ結び付け、さらにエンドソーム–リソソーム融合イベントにも関与することで、RILP は受容体のダウンレギュレーション、リソソーム分解、オートファジーフラックスに影響を与えます。これらの機能により、RILP はエンドリソソーム恒常性の維持と膜輸送経路の中核に位置し、シグナル出力やプロテオスタシスの形成に寄与します。Rab7–RILP 依存的な輸送の破綻は、細胞ストレス応答や、神経変性、感染生物学、ならびにリソソーム機能の変化に対するがん細胞の適応に関連する表現型と結び付けられています。

RILP CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RILPの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

RILP CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RILP 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRILP転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性RILPの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRILP遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRILP依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRILP発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRILP経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。