Ribosomal Protein S19 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402405-ACT

RPS19 codifica a proteína ribossômica S19, um componente essencial da subunidade ribossômica pequena 40S, que dá suporte à biogênese de ribossomos e à iniciação precisa da tradução. Para além do seu papel estrutural no ribossomo, RPS19 contribui para a maturação nucleolar do pré-rRNA e integra-se a programas celulares de proteostase e resposta ao estresse, que acoplam a síntese proteica ao controle do crescimento. A perturbação da função de RPS19 compromete a diferenciação eritroide e está fortemente associada à anemia de Diamond–Blackfan e à sinalização de estresse dependente de p53 ligada a ribossomopatias. Como um gene constitutivo central (housekeeping), a expressão de RPS19 também é usada para avaliar a capacidade translacional, a função nucleolar e a adaptação ao estresse metabólico ou genotóxico em modelos celulares humanos.

Ribosomal Protein S19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RPS19 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ribosomal Protein S19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RPS19 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RPS19, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ribosomal Protein S19. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RPS19 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ribosomal Protein S19 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ribosomal Protein S19 em células tumorais com expressão de RPS19 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.