Ribophorin I CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402286-ACT

RPN1はリボフォリンIをコードしており、リボフォリンIは粗面小胞体膜に埋め込まれたオリゴ糖転移酵素（OST）複合体の必須構成要素です。この複合体は、分泌タンパク質および膜タンパク質の新生鎖に対する翻訳共役型のN結合型糖鎖付加を担います。リボフォリンIは糖鎖転移とタンパク質成熟を協調させることで、小胞体（ER）におけるプロテオスタシス、品質管理、ならびに分泌経路を介した輸送に寄与し、その下流で受容体シグナル伝達や細胞表面プロテオームの構成にも影響を及ぼします。ERにおける糖鎖付加能の変化やOSTサブユニットの制御異常は、複数の疾患関連状況で観察される細胞ストレス応答や異常なタンパク質プロセシングと関連づけられており、RPN1は糖タンパク質生合成を研究するうえで有用な結節点となります。RPN1発現を実験的に操作することで、ER常在の糖鎖付加機構が折りたたみ効率、ER関連分解（ERAD）による分解、そしてより広範なプロテオーム安定性をどのように規定するかを検討できます。

Ribophorin I CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RPN1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Ribophorin I CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RPN1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRPN1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Ribophorin Iの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRPN1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRibophorin I依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRPN1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRibophorin I経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。