REV1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402251-ACT

O REV1 humano codifica uma polimerase de DNA da família Y que atua como um andaime (scaffold) e como uma enzima especializada de síntese por translesão (TLS) durante a tolerância a danos no DNA. O REV1 coordena a inserção de nucleotídeos em frente a bases danificadas e recruta a polimerase ζ por meio de interações com REV7/MAD2L2 e outros fatores de TLS, ajudando as forquilhas de replicação a contornar adutos volumosos no DNA. Essa atividade se integra às respostas ao estresse replicativo, ao reparo pós-replicação e às vias de estabilidade genômica, nas quais um equilíbrio alterado de TLS pode influenciar a mutagênese e a sensibilidade celular ao estresse genotóxico. Assim, o REV1 é amplamente estudado em mecanismos de reparo do DNA, fidelidade de replicação e acúmulo de mutações relevantes para a biologia do câncer e outras condições associadas à instabilidade genômica.

REV1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de REV1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

REV1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus REV1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição REV1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de REV1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus REV1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de REV1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via REV1 em células tumorais com expressão de REV1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.