Recoverin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404106-ACT

O RCVRN humano codifica a recoverina, uma proteína ligante de Ca2+ do tipo EF-hand, enriquecida na retina, que funciona como um “interruptor” Ca2+-miristoíla para modular a fototransdução. Diante de alterações no Ca2+ intracelular durante a adaptação à luz, a recoverina regula a atividade da quinase da rodopsina (GRK1), moldando a dinâmica de fosforilação da rodopsina e a cinética de recuperação em fotorreceptores de bastonetes e cones. Por seu papel na sinalização de GPCR, na homeostase de Ca2+ e na sinalização visual dependente de cGMP, a recoverina sustenta a transdução normal de sinais na retina e a adaptação. Alterações na expressão ou na imunorreatividade da recoverina têm sido associadas a contextos de disfunção retiniana, tornando o RCVRN um alvo relevante para estudos mecanísticos da biologia de fotorreceptores e de redes de sinalização visual.

Recoverin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RCVRN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Recoverin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RCVRN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RCVRN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Recoverin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RCVRN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Recoverin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Recoverin em células tumorais com expressão de RCVRN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.