RBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401569-ACT

O RBP4 humano codifica a proteína ligadora de retinol 4 (RBP), o principal transportador de vitamina A (retinol) na circulação e um determinante-chave do fornecimento de retinoides aos tecidos periféricos. Ao regular a disponibilidade de retinol, o RBP4 influencia programas de transcrição dependentes de ácido retinoico que governam a diferenciação epitelial, a modulação imune e a padronização do desenvolvimento, além de se relacionar com a secreção hepática e com processos do metabolismo lipídico. Alterações na expressão de RBP4 e na homeostase de retinoides têm sido associadas à desregulação metabólica, resistência à insulina e fenótipos inflamatórios, bem como à biologia ocular e hepática, onde o fluxo de vitamina A é rigidamente controlado. Assim, o RBP4 é um ponto útil para dissecar vias de transporte de retinoides e redes regulatórias gênicas a jusante em modelos de células humanas.

RBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RBP4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RBP4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RBP4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RBP4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RBP em células tumorais com expressão de RBP4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.