RAPGEF6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403816-ACT

RAPGEF6 (também conhecido como PDZ-GEF2) codifica um fator de troca de nucleotídeos de guanina específico para Rap que ativa as GTPases RAP1 e RAP2 para coordenar a sinalização “inside-out” de integrinas, a remodelação do citoesqueleto e a dinâmica das junções célula–célula. Por meio da regulação de vias dependentes de Rap, o RAPGEF6 contribui para o controle da adesão, migração e polaridade celulares em múltiplos contextos teciduais. Sua atividade interage com redes de sinalização a jusante de receptores que influenciam circuitos de MAPK e de pequenas GTPases, moldando o tráfego intracelular e a sinalização próxima à membrana. A desregulação da sinalização de Rap e de programas de adesão ligados ao RAPGEF6 é relevante para estudos sobre comportamento celular invasivo, tráfego de células imunes e outras alterações na organização tecidual associadas a doenças.

RAPGEF6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAPGEF6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RAPGEF6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAPGEF6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAPGEF6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RAPGEF6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAPGEF6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RAPGEF6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RAPGEF6 em células tumorais com expressão de RAPGEF6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.