RANK Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423439-ACT

O gene murino **Tnfrsf11a** codifica o **RANK**, um membro da superfamília de receptores de TNF que atua como um transdutor central de sinais para a comunicação dependente de RANKL entre os compartimentos imune, ósseo e estromal. A ativação de RANK recruta adaptadores **TRAF** para estimular as vias de sinalização **NF-κB**, **MAPK** (ERK/JNK/p38) e **PI3K–AKT**, coordenando programas de diferenciação e sobrevivência de osteoclastos e de expressão gênica inflamatória. *In vivo* e *in vitro*, alterações na atividade da via de RANK estão intimamente ligadas à desregulação da remodelação óssea e ao crosstalk do microambiente imune, tornando **Tnfrsf11a** um nó-chave para estudar osteoimunologia e homeostase tecidual. Como receptor com respostas dependentes do contexto, o RANK oferece um ponto de entrada acessível para investigar redes transcricionais a jusante e fenótipos celulares dirigidos por ligantes.

RANK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tnfrsf11a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RANK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tnfrsf11a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tnfrsf11a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RANK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tnfrsf11a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RANK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RANK em células tumorais com expressão de Tnfrsf11a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.