Rab 2A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403154-ACT

O RAB2A humano codifica a pequena GTPase Rab 2A, um regulador central do tráfego vesicular do retículo endoplasmático (RE) para o Golgi e no interior do próprio Golgi, que coordena a triagem de cargas, o ancoramento de vesículas e eventos de fusão por meio do ciclo entre estados ligados a GDP e a GTP. A Rab 2A sustenta a homeostase da via secretória e contribui para a organização de organelas, incluindo a integridade do Golgi e dinâmicas de membrana que influenciam o processamento e a entrega de proteínas. Por seu papel no tráfego de membranas, o RAB2A se cruza com vias que controlam a proteostase, a renovação (turnover) de receptores e respostas ao estresse ligadas ao crescimento e à sobrevivência celular. A sinalização desregulada de GTPases Rab e programas de tráfego, incluindo redes associadas ao RAB2A, são frequentemente estudados no contexto de sinalização oncogênica, neurobiologia e interações patógeno–hospedeiro, nas quais a capacidade de transporte vesicular pode moldar fenótipos relevantes para doenças.

Rab 2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB2A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB2A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB2A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 2A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB2A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 2A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 2A em células tumorais com expressão de RAB2A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.