Rab 11A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400617-ACT

RAB11A codifica a pequena GTPase Rab11A, um regulador central da dinâmica dos endossomos de reciclagem, que coordena o brotamento de vesículas, o transporte e a ancoragem na membrana plasmática. A Rab11A controla a entrega polarizada de membrana, a reciclagem de receptores, a citocinese e a formação do lúmen epitelial ao interagir com proteínas da família Rab11 (FIPs) e ao se acoplar a motores dependentes de actina e de microtúbulos. Por meio dessas funções de tráfego, a Rab11A influencia as respostas de sinalização de receptores de superfície e integrinas e contribui para decisões de triagem endocítica que moldam a migração e a polaridade celulares. A reciclagem dependente de Rab11A desregulada tem sido associada a fenótipos relevantes para a transformação oncogênica, processos neurodegenerativos e interações hospedeiro–patógeno, nas quais o tráfego e a compartimentalização de membranas são perturbados.

Rab 11A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB11A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 11A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB11A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB11A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 11A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB11A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 11A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 11A em células tumorais com expressão de RAB11A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.