Plasmide CRISPR d'Activation (h) PTEN: sc-400103-ACT

PTEN code une phosphatase lipidique et protéique qui s’oppose à la signalisation PI3K en déphosphorylant le PIP3, limitant ainsi l’activation d’AKT et les programmes de croissance en aval dépendants de mTOR. Par cette activité, PTEN régule la progression du cycle cellulaire, le métabolisme, la survie et la migration, et contribue au maintien de la stabilité génomique et de l’homéostasie tissulaire. La fonction de PTEN s’intègre à des voies contrôlant la polarité épithéliale et la dynamique du cytosquelette, influençant l’adhérence et le comportement invasif. La dérégulation de l’expression ou de l’activité de PTEN est fréquemment associée à une signalisation oncogénique ainsi qu’à des processus immunitaires et développementaux altérés, ce qui en fait un nœud largement utilisé pour des études mécanistiques du remaniement des voies de signalisation.

PTEN Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTEN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PTEN Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTEN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTEN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PTEN. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTEN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PTEN au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PTEN dans les cellules tumorales présentant une expression de PTEN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.