PrP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401061-ACT

PRNP codifica la proteina prionica cellulare (PrP), una glicoproteina di membrana ancorata tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI), arricchita sulla superficie neuronale e all’interno dei lipid rafts. PrP partecipa alla proteostasi e a processi di segnalazione associati alla membrana, inclusi il traffico endocitico, l’omeostasi redox e la modulazione della funzione sinaptica attraverso interazioni con componenti della matrice extracellulare e partner di adesione cellulare. Il ripiegamento errato di PrP in conformazioni resistenti alle proteasi è alla base delle encefalopatie spongiformi trasmissibili ed è associato a neurodegenerazione caratterizzata da aggregazione proteica, alterazioni delle risposte cellulari allo stress e progressiva disfunzione neuronale. La regolazione di PRNP è quindi rilevante per lo studio delle vie che governano il controllo di qualità del ripiegamento proteico, la segnalazione neuroinfiammatoria e i meccanismi di sopravvivenza neuronale.

PrP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRNP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PrP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRNP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRNP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PrP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRNP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PrP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PrP nelle cellule tumorali con espressione di PRNP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.