PPX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403212-ACT

PPP4C codifica a subunidade catalítica da fosfatase proteica 4 (também conhecida como PPX), uma fosfatase de serina/treonina que regula redes de sinalização dependentes de fosforilação que controlam a progressão do ciclo celular, a organização do centrossoma, a dinâmica dos microtúbulos e as respostas a danos no DNA. Por meio da associação com subunidades regulatórias, a PPX modula a seletividade por substratos em vias ligadas à remodelação da cromatina e ao controle de checkpoints, influenciando a estabilidade do genoma e a tolerância ao estresse replicativo. Alterações na atividade de PP4/PPP4C têm sido associadas à proliferação desregulada e à sinalização de reparo prejudicada, tornando-a relevante para estudos de biologia tumoral e de outros distúrbios caracterizados por defeitos nas vias de ciclo celular e resposta ao estresse.

PPX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP4C sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PPX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP4C em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP4C, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PPX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP4C nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PPX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PPX em células tumorais com expressão de PPP4C silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.