Plasmide CRISPR d'Activation (h) PPP1R3: sc-405135-ACT

PPP1R3A code PPP1R3, une sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 1 (PP1) ciblant le glycogène, qui aide à localiser la sous-unité catalytique de PP1 sur les particules de glycogène et à coordonner la déphosphorylation d’enzymes métaboliques clés. En modulant l’activité de la glycogène synthase et de la phosphorylase, PPP1R3A contribue à la dynamique du stockage du glucose et intègre la signalisation dépendante de l’insuline au métabolisme des glucides dans le muscle squelettique et d’autres tissus sensibles à l’insuline. Des altérations de l’expression ou de la régulation de PPP1R3A ont été associées à une gestion anormale du glycogène et à des phénotypes métaboliques, ce qui en fait une cible pertinente pour les études sur la signalisation de l’insuline, l’homéostasie énergétique et l’adaptation métabolique spécifique aux tissus. En tant que régulateur de type échafaudage de PP1, PPP1R3A constitue également un nœud accessible pour disséquer les mécanismes de ciblage des phosphatases au sein de réseaux de phosphorylation plus larges.

PPP1R3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PPP1R3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PPP1R3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PPP1R3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PPP1R3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.