POLR3GL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-413599-ACT

O POLR3GL humano codifica uma pequena subunidade da RNA polimerase III que sustenta a transcrição de RNAs não codificantes curtos, incluindo tRNAs, rRNA 5S e outros RNAs dependentes da Pol III essenciais para a capacidade de tradução e a homeostase celular. O POLR3GL contribui para a montagem do complexo Pol III e para a iniciação dependente de promotor, ligando a sua atividade ao controlo do crescimento, à adaptação ao stress e a vias de sinalização da imunidade inata influenciadas por RNAs derivados da Pol III. A desregulação dos programas transcricionais da Pol III é amplamente relevante para fenótipos proliferativos e do desenvolvimento, tornando o POLR3GL um nó útil para estudar como alterações na produção de RNAs não codificantes remodelam redes de expressão génica. Investigar a função do POLR3GL pode esclarecer mecanismos que conectam a atividade da Pol III à regulação transcricional, às exigências de síntese proteica e a estados celulares associados a doenças.

POLR3GL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLR3GL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

POLR3GL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLR3GL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLR3GL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de POLR3GL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLR3GL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de POLR3GL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via POLR3GL em células tumorais com expressão de POLR3GL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.