Plasmide CRISPR d'Activation (h) POL H: sc-401794-ACT

POLH code pour l’ADN polymérase êta (Pol η), une polymérase spécialisée de la famille Y qui réalise la synthèse translésionnelle afin de contourner, pendant la phase S, les dimères cyclobutanes de pyrimidines induits par les UV et d’autres adduits volumineux de l’ADN. En prolongeant des fourches de réplication bloquées, POLH contribue au maintien de la stabilité du génome et agit en coordination avec la réponse aux dommages de l’ADN, la réparation par excision de nucléotides et les voies de réparation post-réplication. Des défauts de POLH compromettent la fidélité du contournement des lésions et augmentent la charge mutationnelle, reliant son dysfonctionnement à une sensibilité aux UV et à des phénotypes de prédisposition au cancer, notamment la forme variante du xeroderma pigmentosum. POLH est donc largement étudié en biologie du stress réplicatif, dans les mécanismes de mutagenèse et dans les interactions entre voies qui gouvernent le choix des mécanismes de réparation de l’ADN.

POL H Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

POL H Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de POL H. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de POL H au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie POL H dans les cellules tumorales présentant une expression de POLH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.