Plásmido CRISPR de Activación (h) PNUTS: sc-403688-ACT

PPP1R10 codifica PNUTS (subunidad reguladora 10 de la fosfatasa proteica 1), una subunidad de direccionamiento nuclear que se une a PP1 y modula la actividad fosfatasa sobre sustratos asociados a la cromatina. PNUTS participa en el control transcripcional, la señalización de la respuesta al daño del ADN y la progresión del ciclo celular al coordinar la desfosforilación de proteínas con las vías de mantenimiento del genoma. Se ha vinculado con la regulación de la transcripción dependiente de la ARN polimerasa II y con procesos que afectan la estabilidad de los telómeros y el estrés de replicación. La alteración de la actividad de PPP1R10/PNUTS se ha asociado con proliferación desregulada y fenotipos de inestabilidad genómica relevantes para la biología del cáncer y otros trastornos que implican reparación del ADN y señalización nuclear deterioradas.

PNUTS El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP1R10 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PNUTS El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP1R10 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP1R10, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PNUTS. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP1R10 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PNUTS en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PNUTS en células tumorales con expresión de PPP1R10 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.