PIRT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416125-ACT

A PIRT humana (regulador de canais TRP que interage com fosfoinositídeos) codifica uma pequena proteína associada à membrana que se liga ao fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) e modula a atividade de canais iónicos selecionados do tipo potencial receptor transitório (TRP). Por meio da regulação do fluxo de cálcio e de cátions dependente de TRP, a PIRT contribui para processos de sinalização sensorial, incluindo nocicepção, termossensação e prurido, ligando a dinâmica de fosfoinositídeos de membrana à excitabilidade neuronal. A sinalização associada à PIRT cruza-se com vias que governam o gating (abertura/fecho) de canais mediado por GPCRs e por lípidos, impactando respostas a segundos mensageiros a jusante e programas de transcrição dependentes de atividade. Alterações na regulação de canais TRP e na sinalização por fosfoinositídeos têm sido implicadas em fenótipos de dor e neuroinflamação, tornando a PIRT um nó útil para estudos mecanísticos em biologia de neurónios sensoriais e em modelos de doença relacionados.

PIRT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PIRT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PIRT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PIRT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PIRT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PIRT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PIRT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PIRT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PIRT em células tumorais com expressão de PIRT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.