PHLPPL CRISPR Activationプラスミド (m): sc-434083-ACT

マウスのPhlpp2は、PP2Cファミリーに属するSer/ThrホスファターゼであるPHLPPLをコードしており、AGCキナーゼ、特にAKTのSer473を脱リン酸化することで増殖因子シグナル伝達を減弱させる。これにより、PI3K–AKT経路のシグナル強度（振幅）を制限し、下流のmTORに連動した代謝および生存プログラムを抑制する。キナーゼのリン酸化を負に制御することを通じて、PHLPPLは増殖、アポトーシス、ストレス応答に関わる細胞の意思決定を形作り、受容体型チロシンキナーゼ（RTK）シグナルネットワーク全体にわたるフィードバック制御にも影響し得る。PHLPP/PHLPPL活性の変化は、腫瘍化に関わるシグナル恒常性の破綻、インスリン／エネルギー代謝、炎症関連の表現型と関連することが文献で報告されており、Phlpp2は経路のバッファリング機構を解明するためのメカニズム研究に有用なノードとなる。キナーゼ駆動のカスケードに拮抗するホスファターゼとして、PHLPPLは細胞モデルにおけるシグナル持続時間の効果や適応的抵抗性機構を解析する上でも重要である。

PHLPPL CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Phlpp2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PHLPPL CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Phlpp2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPhlpp2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PHLPPLの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPhlpp2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPHLPPL依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPhlpp2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPHLPPL経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。