PERK Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400080-LAC

EIF2AK3 umano codifica PERK, una chinasi transmembrana residente nel reticolo endoplasmatico (ER) che funge da sensore primario dello stress del reticolo endoplasmatico nella risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response, UPR). Una volta attivata, PERK fosforila eIF2α per attenuare la traduzione globale, promuovendo al contempo la traduzione selettiva di trascritti responsivi allo stress come ATF4, coordinando così l’equilibrio redox, il metabolismo degli amminoacidi e i programmi di autofagia. La segnalazione di PERK si interfaccia con la proteostasi, la funzione mitocondriale e le vie infiammatorie, influenzando le decisioni di destino cellulare tra adattamento e apoptosi durante stress prolungato. Un’attività deregolata di EIF2AK3/PERK è stata implicata in patologie caratterizzate da stress cronico dell’ER, incluse neurodegenerazione, disfunzioni metaboliche e adattamento del microambiente tumorale, rendendolo un nodo chiave per studi meccanicistici della segnalazione di stress.

Le particelle di attivazione lentivirale PERK (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di EIF2AK3 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PERK (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione EIF2AK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PERK. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo EIF2AK3 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.