Perforin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400976-ACT

PRF1 kodiert Perforin 1, einen porenbildenden zytolytischen Effektor, der für das granula-vermittelte Abtöten durch zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen essenziell ist. Nach der Bildung der immunologischen Synapse erleichtert Perforin die Einschleusung von Granzymen in Zielzellen, um apoptotische Programme auszulösen, und ist dabei in Signalwege eingebunden, die Immunüberwachung, antivirale Abwehr und Tumor-Immunoediting steuern. Die PRF1-Aktivität ist eng an den Aktivierungszustand von Lymphozyten und die Dynamik der Degranulation gekoppelt; veränderte Expression oder Funktion wird mit Phänotypen der Immundysregulation in Verbindung gebracht, darunter beeinträchtigte Zytotoxizität und hyperinflammatorische Syndrome. Als Kernkomponente der zellvermittelten Zytotoxizität wird PRF1 in Kontexten wie Infektionsbiologie, Immunflucht und entzündungsbedingten Gewebeschäden breit untersucht.

Perforin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Perforin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Perforin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Perforin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Perforin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.