PDK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401084-ACT

A PDK1 humana (quinase 1 da piruvato desidrogenase) é uma quinase mitocondrial que fosforila e inibe o complexo piruvato desidrogenase, limitando a conversão de piruvato em acetil‑CoA e desviando o fluxo de carbono para longe da oxidação mitocondrial. Ao acoplar a disponibilidade de nutrientes e a tensão de oxigênio ao metabolismo central do carbono, a PDK1 influencia a glicólise, a entrada no ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico) e o balanço redox celular, sendo comumente associada à remodelação metabólica responsiva à hipóxia. Alterações na atividade da PDK1 têm sido associadas a fenótipos proliferativos e de adaptação ao estresse observados no metabolismo do câncer e em outros distúrbios que envolvem disfunção mitocondrial.

PDK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDK1 em células tumorais com expressão de PDK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.