PDI CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400676-ACT

ヒトのP4HBは、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）をコードしている。PDIはチオール–ジスルフィド酸化還元酵素であり、小胞体（ER）常在のシャペロンとして、ジスルフィド結合の形成、還元、異性化を触媒し、酸化的タンパク質フォールディングを支える。PDIはERプロテオスタシス・ネットワークの中核要素で、アンフォールド・プロテイン・レスポンス（UPR）シグナル伝達、ER関連分解（ERAD）、ならびに分泌タンパク質および膜タンパク質の品質管理に寄与する。さらに、レドックス恒常性とシャペロン活性における役割を通じて、PDIは酸化ストレス、低酸素、代謝の攪乱に対する細胞応答に影響を及ぼし、これらは炎症や生存経路とも交差する。P4HB/PDI活性の破綻や発現上昇は、プロテオトキシックストレスや腫瘍生物学の文脈でしばしば研究対象となるほか、ERストレス経路の関与が示される神経変性や線維化リモデリングにおいても注目されている。

PDI CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性P4HBの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PDI CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における P4HB 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はP4HB転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PDIの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のP4HB遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPDI依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびP4HB発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPDI経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。