PDC-E2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402520-ACT

Das humane DLAT kodiert PDC‑E2 (Dihydrolipoamid‑Acetyltransferase), die E2‑Kernuntereinheit des mitochondrialen Pyruvatdehydrogenase‑Komplexes, der das aus der Glykolyse stammende Pyruvat in den Citratzyklus einspeist, indem er Acetyl‑CoA erzeugt. Dieses lipoatabhängige Enzym unterstützt den zentralen Kohlenstofffluss, das Redoxgleichgewicht und den mitochondrialen Energiestoffwechsel und koppelt funktionell die Pyruvatoxidation an die respiratorische Kapazität. Die DLAT/PDC‑E2‑Aktivität steht über ihren Einfluss auf die NADH‑Produktion und den nachgeschalteten Elektronentransport in Wechselwirkung mit Nährstoffsensorik und oxidativen Stressantworten. Eine Fehlregulation von Komponenten des Pyruvatdehydrogenase‑Komplexes ist mit der metabolischen Umprogrammierung verbunden, wie sie in Krebs- und neurodegenerativen Kontexten beobachtet wird, und PDC‑E2 ist zudem für Studien zur mitochondrialen Autoantigen‑Biologie relevant.

PDC-E2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DLAT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDC-E2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DLAT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DLAT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDC-E2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DLAT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDC-E2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDC-E2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DLAT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.