Plasmide CRISPR d'Activation (h) PD-ECGF: sc-403836-ACT

TYMP code la thymidine phosphorylase, également appelée facteur de croissance des cellules endothéliales dérivé des plaquettes (PD-ECGF), une enzyme cytosolique qui catalyse la phosphorolyse de la thymidine et de la désoxyuridine afin de réguler les pools de nucléosides et la voie de récupération des nucléotides. Par son impact sur le métabolisme des pyrimidines, TYMP influence les réponses au stress de réplication de l’ADN, l’équilibre des nucléotides mitochondriaux, ainsi que l’homéostasie redox et métabolique globale de la cellule. L’activité du PD-ECGF a été associée à la biologie endothéliale et au remodelage tissulaire via des effets de signalisation induits par des métabolites, reliant le métabolisme des nucléosides aux programmes angiogéniques. Une expression ou une fonction dérégulée de TYMP est liée à des altérations du métabolisme des nucléotides observées dans des troubles prolifératifs et mitochondriaux, ce qui soutient son utilisation comme cible pour des études mécanistiques dans des modèles de maladies associées au métabolisme.

PD-ECGF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TYMP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PD-ECGF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TYMP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TYMP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PD-ECGF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TYMP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PD-ECGF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PD-ECGF dans les cellules tumorales présentant une expression de TYMP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.