PARG Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404382-ACT

A poli(ADP-ribose) glico-hidrolase (PARG) é a principal enzima responsável por hidrolisar as cadeias de poli(ADP-ribose) (PAR) sintetizadas por membros da família PARP, encerrando assim a sinalização de PARilação e restaurando a função proteica após respostas ao estresse. Ao regular o turnover de PAR, a PARG ajuda a controlar a detecção e o reparo de danos no DNA, a remodelagem da cromatina, a tolerância ao estresse replicativo e vias de morte celular como a parthanatos, por meio da modulação do recrutamento de proteínas dependente de PAR. A atividade da PARG se conecta aos processos de reparo por excisão de base e de reparo de quebras de fita simples, influenciando a estabilidade do genoma e programas transcricionais ligados à adaptação celular ao estresse. A desregulação do metabolismo de PAR tem sido associada à biologia do câncer e à neurodegeneração, tornando a PARG um alvo útil para estudos mecanísticos da capacidade de reparo do DNA, da dinâmica da cromatina e da sinalização induzida por estresse.

PARG O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PARG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PARG O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PARG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PARG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PARG. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PARG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PARG no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PARG em células tumorais com expressão de PARG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.