PAPD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412459-ACT

MTPAP kodiert die mitochondriale Poly(A)-Polymerase PAPD1, ein RNA-prozessierendes Enzym, das mitochondriale mRNAs mit Poly(A)-Schwänzen versieht, um die Stabilität und Reifung der Transkripte sowie eine effiziente mitochondriale Translation zu unterstützen. Über seine Rolle in der mitochondrialen Genexpression trägt PAPD1 zur Kapazität der oxidativen Phosphorylierung, zur Homöostase der Atmungskette und zu übergeordneten Programmen der mitochondrialen Qualitätskontrolle bei. Eine dysregulierte Polyadenylierung mitochondrialer RNA kann den Energiestoffwechsel stören und zelluläre Stressantworten verstärken, die mit neuromuskulären und neurodegenerativen Phänotypen in Verbindung stehen. Daher wird MTPAP/PAPD1 häufig in Signalwegen untersucht, die die mitochondriale RNA-Biologie mit Bioenergetik, Proteostase und dem Zellüberleben unter metabolischem Stress verknüpfen.

PAPD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MTPAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PAPD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MTPAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MTPAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PAPD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MTPAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PAPD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PAPD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MTPAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.