P2Y1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422095-ACT

O gene P2ry1 de camundongo codifica o receptor purinérgico P2Y1, um receptor acoplado à proteína G ativado por ADP extracelular que se acopla principalmente a Gq/11 para estimular a sinalização da fosfolipase C, a produção de fosfatos de inositol e a mobilização intracelular de Ca2+. O P2Y1 contribui para a neurotransmissão purinérgica, vias de agregação semelhantes às plaquetárias, regulação do tônus vascular e ativação de células imunes ao integrar a liberação de nucleotídeos com redes de segundos mensageiros a jusante. Por meio de comunicação cruzada com MAPK e outras vias dependentes de cálcio, o P2Y1 modula secreção, migração e excitabilidade em diversos tecidos. A sinalização purinérgica desregulada envolvendo o P2Y1 tem sido implicada em fenótipos relacionados a trombose e hemostasia, respostas inflamatórias e disfunção neurovascular, reforçando sua relevância para a modelagem mecanística de doenças.

P2Y1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de P2ry1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

P2Y1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus P2ry1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição P2ry1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de P2Y1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus P2ry1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de P2Y1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via P2Y1 em células tumorais com expressão de P2ry1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.