Orexin R-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401613-ACT

O HCRTR1 codifica o receptor de orexina 1 (Orexin R-1), um GPCR de classe A que se liga aos neuropeptídeos orexina-A e orexina-B para regular a vigília, a estabilidade do ciclo sono–vigília, o comportamento alimentar, o processamento de recompensa e a homeostase neuroendócrina. Após a ligação do ligante, o Orexin R-1 acopla-se a Gq/11 e a outras proteínas G para ativar a PLCβ, elevar o Ca2+ intracelular e estimular a sinalização MAPK/ERK a jusante, com comunicação cruzada adicional com as vias de cAMP/PKA e PI3K dependendo do contexto celular. Essa sinalização influencia a excitabilidade neuronal e a plasticidade sináptica, integrando entradas hipotalâmicas com circuitos mais amplos do cérebro. A desregulação da sinalização de orexina e da atividade de HCRTR1 tem sido associada a fenótipos de sono e circadianos e é frequentemente estudada em relação à responsividade ao estresse, ao controle metabólico e a vias associadas a doenças neuropsiquiátricas.

Orexin R-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HCRTR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Orexin R-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HCRTR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HCRTR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Orexin R-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HCRTR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Orexin R-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Orexin R-1 em células tumorais com expressão de HCRTR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.