Orexin-A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400357-ACT

O HCRT humano codifica a prepro-orexina, que é processada proteoliticamente para gerar a orexina-A, um neuropeptídeo que sinaliza principalmente por meio de OX1R e OX2R (HCRTR1/HCRTR2) para regular o estado de vigília, a estabilidade do ciclo sono–vigília, o comportamento alimentar, o processamento de recompensa e a homeostase autonômica. A orexina-A ativa vias mediadas por GPCR, incluindo sinalização acoplada a Gq/11 e Gi/o, modulando a dinâmica do cálcio intracelular, a atividade de MAPK/ERK e a excitabilidade neuronal em circuitos do hipotálamo e do tronco encefálico. A desregulação da sinalização de orexina está fortemente associada a distúrbios do sono, como a narcolepsia, e a fenótipos mais amplos envolvendo equilíbrio metabólico e responsividade ao estresse. Na pesquisa biomédica, HCRT/orexina-A é utilizada para investigar a função de redes neuromodulatórias, a integração em nível de circuito do estado energético e programas transcricionais associados à vigília e à motivação.

Orexin-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HCRT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Orexin-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HCRT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HCRT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Orexin-A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HCRT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Orexin-A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Orexin-A em células tumorais com expressão de HCRT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.