ORC2 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402746-ACT

ヒトORC2は、複製起点認識複合体（ORC）の中核サブユニットをコードしており、複製起点に結合してプレ複製複合体の組み立てを協調し、細胞周期あたり1回のDNA合成を確実にします。ORC2はクロマチン制御と複製ライセンシングの接点で機能し、G1期におけるCDC6、CDT1、およびMCMヘリカーゼのロードと連携しながら、S期への移行とゲノム安定性を支えます。ORC2活性が攪乱されると、複製タイミングや複製フォークの進行が損なわれ、複製ストレスやDNA損傷応答が増大する可能性があり、これらは増殖性疾患でしばしば関与が指摘されます。複製起点の機能成立を左右する中心的因子として、ORC2は細胞周期制御、クロマチン関連のDNA代謝、ならびにゲノム完全性を保護する機構の研究において広く注目されています。

ORC2 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ORC2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

ORC2 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ORC2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はORC2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性ORC2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のORC2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるORC2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびORC2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるORC2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。