Orai3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403426-ACT

ORAI3 codifica Orai3, una subunità di un canale CRAC (Calcium Release–Activated Calcium) del Ca2+ localizzato nella membrana plasmatica, che contribuisce all’ingresso di calcio operato dai depositi (SOCE) in seguito alla deplezione di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico. Modellando la dinamica del Ca2+ citosolico, Orai3 influenza programmi di segnalazione a valle dipendenti dal Ca2+, inclusi la trascrizione guidata da NFAT, la progressione del ciclo cellulare e la secrezione accoppiata allo stimolo. La funzione di ORAI3 interagisce con le proteine STIM e con altri membri della famiglia ORAI per modulare l’assemblaggio del canale e la selettività ionica, regolando così l’eccitabilità cellulare e le risposte allo stress. In letteratura, un’espressione deregolata di ORAI3 o il rimodellamento della SOCE sono stati associati a alterazioni della segnalazione proliferativa, della gestione dello stress ossidativo e a fenotipi rilevanti per la biologia del cancro e per la funzione delle cellule immunitarie.

Orai3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ORAI3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Orai3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ORAI3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ORAI3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Orai3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ORAI3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Orai3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Orai3 nelle cellule tumorali con espressione di ORAI3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.