nucleobindin 2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424686-ACT

O gene Nucb2 de camundongo codifica a nucleobindina 2, uma proteína ligante de Ca2+ contendo motivos EF-hand, que se localiza em compartimentos da via secretória e participa da secreção regulada e da homeostase celular de Ca2+. A nucleobindina 2 tem sido associada à sinalização neuroendócrina por meio de seu processamento em peptídeos relacionados à nesfatina-1, com papéis descritos no apetite/equilíbrio energético e em respostas associadas ao estresse. Em tecidos periféricos, alterações na expressão de Nucb2 têm sido estudadas no contexto da regulação metabólica, da sinalização associada à inflamação e da adaptação celular ao estado nutricional. Essas características tornam o Nucb2 um alvo útil para dissecar o tráfego dependente de Ca2+, a biologia de grânulos secretórios e o crosstalk neuroendócrino-metabólico em modelos murinos.

nucleobindin 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Nucb2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nucleobindin 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Nucb2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Nucb2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nucleobindin 2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Nucb2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nucleobindin 2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nucleobindin 2 em células tumorais com expressão de Nucb2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.